藁本中两种活性成分的高效液相色谱法测定
作者：张金兰 李农 陈若云 周志华 周同惠
单位：中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所,北京 100050
关键词：藁本；阿魏酸；藁本酚；高效液相色谱法
药学学报990214 摘要 目的：为中药藁本内在质量的评价提供科学依据，建立了藁本中两种活性成分:阿魏酸(ferulic acid)、藁本酚(ligustiphenol)的定量分析方法。方法：反相高效液相色谱法，采用 7μm Nucleosil-C18键合相柱,流动相为MeOH—H2O(40～60),以H3PO4调至pH 3.6，2-萘酚为内标，280 nm为检测波长。结果：阿魏酸与藁本酚可达基线分离，两者标准品的进样量分别为0.27～4.38 μg和0.55～8.80 μg，对样品峰面积与内标峰面积比呈良好线性关系。平均回收率为97.4%～100.9%。用此法对不同产地野生及市售中国藁本及辽藁本的根及根茎进行了分析，测得了阿魏酸及藁本酚的含量，不同产地的藁本药材中此两种活性成分的含量差别较大。结论：此法简便、快速，适用于药材分析，可作为证实地道药材的化学依据。
, 百拇医药
HPLC DETERMINATION OF TWO ACTIVE CONSTITUENTS
IN PLANTS OF GENUS LIGUSTICUM
Zhang Jinlan (Zhang JL), Li Nong (Li N), Chen Ruoyun (Chen RY),Zhou Zhihua (Zhou ZH) and Zhou Tonghui (Zhou TH)
(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College, Beijing 100050)
ABSTRACT AIM: To evaluate the quality of Chinese herb Ligusticum, a RP-HPLC method was established to separate and determine the two active constituents, ferulic acid and ligustiphenol, in plants of genus Ligusticum. METHODS: ODS column (Nucleosil-C18, 7 μm) was used. MeOH—H2O (40∶60) adjusted to pH 3.6 by H3PO4 was the mobile phase with detection at 280 nm. 2-Naphthol was used as the internal standard. RESULTS: Ferulic acid and ligustiphenol were separated baselinely. The peak area ratios of the two compounds to internal standard were linear when the injection amount were from 0.27 to 4.38 μg and from 0.55 to 8.80 μg, respectively. The average recoveries were 97.3%～100.9%. Quantitive determination of the two active constituents in the rhizoma of Ligusticum from different habitats was investigated using this method. There was great difference in the quantity of the two active constituents in the rhizoma of Ligusticum from different habitats. CONCLUSION: The contents of ferulic acid and ligustiphenol in genuine drugs of Ligusticum were higher than from other habitats. The results showed that the two active constituents were as a scientific basis for evaluating the genuine drugs of Ligusticum.
, 百拇医药
KEY WORDS HPLC; Ligusticum; ferulic acid; ligustiphenol
藁本为伞形科藁本属植物辽藁本(Ligusticum jeholense Nakai et Kitagawa)及中国藁本(L.Sinense Oliv)的根及根茎[1]。阿魏酸是藁本的主要化学成分,有增加冠脉血流量和抑制血小板聚集的作用[2]，我们曾对其作了含量测定[3]。我所近年来对藁本的化学成分进行了深入的研究,从中发现了一些新化合物,藁本酚[4]就是其中之一,药理研究表明藁本酚有免疫抑制作用。因此我们选择阿魏酸和藁本酚这两种与中医临床应用功效基本吻合的成分作为定量分析的指标,为中药藁本内在质量的评价提供科学依据。本文采用7 μm Nucleosil-C18键合相柱,以MeOH—H2O(40∶60，pH 3.6)为流动相,使藁本中的两种有效成分得到较好的分离,方法简便、易行、快速。
, 百拇医药
实验部分
1 仪器与药品
高效液相色谱仪:岛津SPD-1(日本);泵:兴达LP-10C;色谱柱: 4.6 mm×200 mm;固定相:Nucleosil-C18(7 μm)。
甲醇:色谱纯,北京化工厂;水:二次重蒸水;磷酸:分析纯,吉林省军区化工厂;2-萘酚:分析纯,北京瀛海精细化工厂。
标准品：阿魏酸及藁本酚从植物中国藁本中提取分离得到,经光谱分析鉴定结构，HPLC检测,含量均在98%以上。
药材:中国藁本及辽藁本共18个产地的样品均经本所宋万志教授鉴定。
2 实验条件
2.1 分离条件的选择 以Nucleosil-C18(7 μm)为固定相,试验了甲醇—水溶剂系统,研究了甲醇量以及流动相pH值对分离的影响。最终确定用ø4.6 mm×20 mm ODS柱,流动相为甲醇—水(40∶60)以H3PO4调至pH 3.6，阿魏酸与藁本酚和药材中的干扰峰达基线分离,得到较好的分离效果。
, 百拇医药
2.2 内标选择 通过对10个化合物进行试验,证实2-萘酚符合要求，分离结果较好。
2.3 线性关系 精密称取各标准品2 mg，分别置于1 ml量瓶中,用甲醇溶解并定容。精密称取2-萘酚10 mg于5 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容。精密吸取阿魏酸标准溶液12.5，25，50，100，200 μl及藁本酚标准溶液25，50，100，200，400 μl分别置于1 ml量瓶中,加入内标溶液25 μl,加甲醇定容至刻度,混匀,得到2个标准品的5种不同浓度含内标的混合液。在上述色谱条件下进行色谱分析,积分仪计算峰面积，阿魏酸和藁本酚标准品的进样量分别为0.27～4.38 μg和0.55～8.80 μg，对样品峰面积与内标峰面积比呈良好线性关系(表1)。标准品进样相对标准偏差均在2.6%以内(n=5)。
Tab 1 Data of standard calibration curves Compound
, 百拇医药
Regressive equation
Correlation
coefficient
Linear range
/ μg
Ferulic acid
Y=2.878X-0.009
0.9994
0.27～4.38
Ligustiphenol
Y=0.4607X-0.042
, 百拇医药
0.9995
0.55～8.80
2.4 提取方法 以沈阳郊区野生辽藁本为样品,比较了不同比例甲醇及甲醇—丙酮混合溶剂的提取效果,结果甲醇提取效率最高而且完全。进一步试验了提取方法和时间,精密称取样品粉末(过30目筛)50 mg于10 ml刻度试管中，共4份，分别加甲醇5 ml，冷浸过夜后,超声10，20，30，及40 min。进样量相同,比较峰面积与内标峰面积比。结果表明:冷浸过夜超声20 min的方法提取效率最高。
2.5 回收率 精密称取上述辽藁本样品粉末(过30目筛)50 mg于10 ml刻度试管中,共4份,其中两份加入混合标准品溶液,分别加甲醇5 ml,冷浸过夜,超声20 min,以3 500 r.min-1离心,取上清液经0.45 μm针式滤器过滤,取滤液4 ml浓缩蒸干。于1 ml量瓶中加入25 μl内标,用少量甲醇溶解浓缩提取物并转移至此量瓶中,再用少量甲醇多次洗涤容器,合并洗液于量瓶中,甲醇定容。进样10 μl,按色谱条件进行分析,计算峰面积,平均回收率97.4%～100.9%(表2)。
, 百拇医药
2.6 样品分析 对不同产地野生及市购中国藁本及辽藁本的根及根茎,按上述方法提取后,按拟定方法测定了18个样品,两种活性成分含量差别较大，辽藁本中不含藁本酚。结果见表3，分离结果见图1。Tab 2 Recovery of two compounds Compound
Amount in sample
/ μg
Amount added
/ μg
Total amount determined
/ μg
Amount found
/ μg
, 百拇医药
Recovery
/ %
Ferulic acid
0.040
1.090
1.100
1.060
97.3
Ligustiphenol
0.000
1.000
1.009
, 百拇医药
1.009
100.9
Tab 3 Contents of ferulic acid and ligustiphenol in root and rhizoma of Ligusticum sinense and Ligusticum jeholense in different habitats
Habitat
Content / %
Ferulic acid
Ligustiphenol
Ligusticum sinense
Ezhou, Hubei Province
, http://www.100md.com
0.103
0.166
Wudu, Gansu Province
0.024
Lingbao, Henan Province
0.026
Ankang, Shanxi Province
0.133
Mianyang, Sichuan Province
0.051
trace
, 百拇医药
Wild habitated in Dagong Mountain
of Zhangjiajie, Hubei Province
0.053
Songbo Town, Hubei Province
0.098
Ludai, Henan Province
0.004
Zhangjiajie, Hubei Province
0.076
Zhengping Town, Henan Province
, 百拇医药
0.089
Ligusticum jeholense
Tongrentang, Beijing
0.057
Labagou, Huairou County, Beijing
0.039
Anshan, Liaoning Province 0.093
0.083
Chifeng, Inner Mongolia
0.070
, 百拇医药
Shengyang Pharmaceutical Corp.
0.185
Chengde, Hebei Province
0.200
Huhehot, Inner Mongolia
0.115
Wild plant in suburb of Shenyang,Liaoning Province
0.041
Fig 1 Chromatogram of L.sinense from Ezhou, Hubei Province (A) and L.jeholense from Tongrentang, Beijing (B). 1. Ferulic acid; 2. Ligustiphenol; 3. Internal standard (2-naphthol).
, http://www.100md.com
讨论
不同产地的藁本药材所含上述两种活性成分的量差别很大,阿魏酸在18个产地的药材中均含有,其中河北承德市售辽藁本中含量最高。藁本酚只在3个产地的药材中含有,而且含量差异很大，以湖北鄂州市售中国藁本中含量最高。由此可以看出各地藁本药材的内在质量有很大不同,进一步证实使用“地道药材”确有其化学依据,同时也说明对中药材进行有效成分内在质量规范化研究是很必要的。关于这些内在质量差别很大的药材在药理及临床上所表现的异同,还有待进一步的研究。
Tel:(010)63165236, Fax:(010)63017757
基金项目：国家中医药管理局“中药材质量标准的规范化研究”资助项目(96-903-02-02)
参考文献
1 江西新医学院编.中药大词典,下册.上海：上海科学技术出版社,1992.2674
2 王普善.中药川芎化学成分及其生理活性研究的回顾与展望.医药工业,1988,19∶553
3 张金兰，何秀峰，周志华.藁本中5种成分的高效液相色谱法测定.药学学报，1996,31∶622
4 Yu DQ, Xie FZ, Chen RY, et al. Studies on the structure of ligustiphenol from Ligusticum sinense Oliv. Chin Chem Lett, 1996,7∶721
收稿日期：1998-06-24, 百拇医药
单位：中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所,北京 100050
关键词：藁本；阿魏酸；藁本酚；高效液相色谱法
药学学报990214 摘要 目的：为中药藁本内在质量的评价提供科学依据，建立了藁本中两种活性成分:阿魏酸(ferulic acid)、藁本酚(ligustiphenol)的定量分析方法。方法：反相高效液相色谱法，采用 7μm Nucleosil-C18键合相柱,流动相为MeOH—H2O(40～60),以H3PO4调至pH 3.6，2-萘酚为内标，280 nm为检测波长。结果：阿魏酸与藁本酚可达基线分离，两者标准品的进样量分别为0.27～4.38 μg和0.55～8.80 μg，对样品峰面积与内标峰面积比呈良好线性关系。平均回收率为97.4%～100.9%。用此法对不同产地野生及市售中国藁本及辽藁本的根及根茎进行了分析，测得了阿魏酸及藁本酚的含量，不同产地的藁本药材中此两种活性成分的含量差别较大。结论：此法简便、快速，适用于药材分析，可作为证实地道药材的化学依据。
, 百拇医药
HPLC DETERMINATION OF TWO ACTIVE CONSTITUENTS
IN PLANTS OF GENUS LIGUSTICUM
Zhang Jinlan (Zhang JL), Li Nong (Li N), Chen Ruoyun (Chen RY),Zhou Zhihua (Zhou ZH) and Zhou Tonghui (Zhou TH)
(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College, Beijing 100050)
ABSTRACT AIM: To evaluate the quality of Chinese herb Ligusticum, a RP-HPLC method was established to separate and determine the two active constituents, ferulic acid and ligustiphenol, in plants of genus Ligusticum. METHODS: ODS column (Nucleosil-C18, 7 μm) was used. MeOH—H2O (40∶60) adjusted to pH 3.6 by H3PO4 was the mobile phase with detection at 280 nm. 2-Naphthol was used as the internal standard. RESULTS: Ferulic acid and ligustiphenol were separated baselinely. The peak area ratios of the two compounds to internal standard were linear when the injection amount were from 0.27 to 4.38 μg and from 0.55 to 8.80 μg, respectively. The average recoveries were 97.3%～100.9%. Quantitive determination of the two active constituents in the rhizoma of Ligusticum from different habitats was investigated using this method. There was great difference in the quantity of the two active constituents in the rhizoma of Ligusticum from different habitats. CONCLUSION: The contents of ferulic acid and ligustiphenol in genuine drugs of Ligusticum were higher than from other habitats. The results showed that the two active constituents were as a scientific basis for evaluating the genuine drugs of Ligusticum.
, 百拇医药
KEY WORDS HPLC; Ligusticum; ferulic acid; ligustiphenol
藁本为伞形科藁本属植物辽藁本(Ligusticum jeholense Nakai et Kitagawa)及中国藁本(L.Sinense Oliv)的根及根茎[1]。阿魏酸是藁本的主要化学成分,有增加冠脉血流量和抑制血小板聚集的作用[2]，我们曾对其作了含量测定[3]。我所近年来对藁本的化学成分进行了深入的研究,从中发现了一些新化合物,藁本酚[4]就是其中之一,药理研究表明藁本酚有免疫抑制作用。因此我们选择阿魏酸和藁本酚这两种与中医临床应用功效基本吻合的成分作为定量分析的指标,为中药藁本内在质量的评价提供科学依据。本文采用7 μm Nucleosil-C18键合相柱,以MeOH—H2O(40∶60，pH 3.6)为流动相,使藁本中的两种有效成分得到较好的分离,方法简便、易行、快速。
, 百拇医药
实验部分
1 仪器与药品
高效液相色谱仪:岛津SPD-1(日本);泵:兴达LP-10C;色谱柱: 4.6 mm×200 mm;固定相:Nucleosil-C18(7 μm)。
甲醇:色谱纯,北京化工厂;水:二次重蒸水;磷酸:分析纯,吉林省军区化工厂;2-萘酚:分析纯,北京瀛海精细化工厂。
标准品：阿魏酸及藁本酚从植物中国藁本中提取分离得到,经光谱分析鉴定结构，HPLC检测,含量均在98%以上。
药材:中国藁本及辽藁本共18个产地的样品均经本所宋万志教授鉴定。
2 实验条件
2.1 分离条件的选择 以Nucleosil-C18(7 μm)为固定相,试验了甲醇—水溶剂系统,研究了甲醇量以及流动相pH值对分离的影响。最终确定用ø4.6 mm×20 mm ODS柱,流动相为甲醇—水(40∶60)以H3PO4调至pH 3.6，阿魏酸与藁本酚和药材中的干扰峰达基线分离,得到较好的分离效果。
, 百拇医药
2.2 内标选择 通过对10个化合物进行试验,证实2-萘酚符合要求，分离结果较好。
2.3 线性关系 精密称取各标准品2 mg，分别置于1 ml量瓶中,用甲醇溶解并定容。精密称取2-萘酚10 mg于5 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容。精密吸取阿魏酸标准溶液12.5，25，50，100，200 μl及藁本酚标准溶液25，50，100，200，400 μl分别置于1 ml量瓶中,加入内标溶液25 μl,加甲醇定容至刻度,混匀,得到2个标准品的5种不同浓度含内标的混合液。在上述色谱条件下进行色谱分析,积分仪计算峰面积，阿魏酸和藁本酚标准品的进样量分别为0.27～4.38 μg和0.55～8.80 μg，对样品峰面积与内标峰面积比呈良好线性关系(表1)。标准品进样相对标准偏差均在2.6%以内(n=5)。
Tab 1 Data of standard calibration curves Compound
, 百拇医药
Regressive equation
Correlation
coefficient
Linear range
/ μg
Ferulic acid
Y=2.878X-0.009
0.9994
0.27～4.38
Ligustiphenol
Y=0.4607X-0.042
, 百拇医药
0.9995
0.55～8.80
2.4 提取方法 以沈阳郊区野生辽藁本为样品,比较了不同比例甲醇及甲醇—丙酮混合溶剂的提取效果,结果甲醇提取效率最高而且完全。进一步试验了提取方法和时间,精密称取样品粉末(过30目筛)50 mg于10 ml刻度试管中，共4份，分别加甲醇5 ml，冷浸过夜后,超声10，20，30，及40 min。进样量相同,比较峰面积与内标峰面积比。结果表明:冷浸过夜超声20 min的方法提取效率最高。
2.5 回收率 精密称取上述辽藁本样品粉末(过30目筛)50 mg于10 ml刻度试管中,共4份,其中两份加入混合标准品溶液,分别加甲醇5 ml,冷浸过夜,超声20 min,以3 500 r.min-1离心,取上清液经0.45 μm针式滤器过滤,取滤液4 ml浓缩蒸干。于1 ml量瓶中加入25 μl内标,用少量甲醇溶解浓缩提取物并转移至此量瓶中,再用少量甲醇多次洗涤容器,合并洗液于量瓶中,甲醇定容。进样10 μl,按色谱条件进行分析,计算峰面积,平均回收率97.4%～100.9%(表2)。
, 百拇医药
2.6 样品分析 对不同产地野生及市购中国藁本及辽藁本的根及根茎,按上述方法提取后,按拟定方法测定了18个样品,两种活性成分含量差别较大，辽藁本中不含藁本酚。结果见表3，分离结果见图1。Tab 2 Recovery of two compounds Compound
Amount in sample
/ μg
Amount added
/ μg
Total amount determined
/ μg
Amount found
/ μg
, 百拇医药
Recovery
/ %
Ferulic acid
0.040
1.090
1.100
1.060
97.3
Ligustiphenol
0.000
1.000
1.009
, 百拇医药
1.009
100.9
Tab 3 Contents of ferulic acid and ligustiphenol in root and rhizoma of Ligusticum sinense and Ligusticum jeholense in different habitats
Habitat
Content / %
Ferulic acid
Ligustiphenol
Ligusticum sinense
Ezhou, Hubei Province
, http://www.100md.com
0.103
0.166
Wudu, Gansu Province
0.024
Lingbao, Henan Province
0.026
Ankang, Shanxi Province
0.133
Mianyang, Sichuan Province
0.051
trace
, 百拇医药
Wild habitated in Dagong Mountain
of Zhangjiajie, Hubei Province
0.053
Songbo Town, Hubei Province
0.098
Ludai, Henan Province
0.004
Zhangjiajie, Hubei Province
0.076
Zhengping Town, Henan Province
, 百拇医药
0.089
Ligusticum jeholense
Tongrentang, Beijing
0.057
Labagou, Huairou County, Beijing
0.039
Anshan, Liaoning Province 0.093
0.083
Chifeng, Inner Mongolia
0.070
, 百拇医药
Shengyang Pharmaceutical Corp.
0.185
Chengde, Hebei Province
0.200
Huhehot, Inner Mongolia
0.115
Wild plant in suburb of Shenyang,Liaoning Province
0.041
Fig 1 Chromatogram of L.sinense from Ezhou, Hubei Province (A) and L.jeholense from Tongrentang, Beijing (B). 1. Ferulic acid; 2. Ligustiphenol; 3. Internal standard (2-naphthol).
, http://www.100md.com
讨论
不同产地的藁本药材所含上述两种活性成分的量差别很大,阿魏酸在18个产地的药材中均含有,其中河北承德市售辽藁本中含量最高。藁本酚只在3个产地的药材中含有,而且含量差异很大，以湖北鄂州市售中国藁本中含量最高。由此可以看出各地藁本药材的内在质量有很大不同,进一步证实使用“地道药材”确有其化学依据,同时也说明对中药材进行有效成分内在质量规范化研究是很必要的。关于这些内在质量差别很大的药材在药理及临床上所表现的异同,还有待进一步的研究。
Tel:(010)63165236, Fax:(010)63017757
基金项目：国家中医药管理局“中药材质量标准的规范化研究”资助项目(96-903-02-02)
参考文献
1 江西新医学院编.中药大词典,下册.上海：上海科学技术出版社,1992.2674
2 王普善.中药川芎化学成分及其生理活性研究的回顾与展望.医药工业,1988,19∶553
3 张金兰，何秀峰，周志华.藁本中5种成分的高效液相色谱法测定.药学学报，1996,31∶622
4 Yu DQ, Xie FZ, Chen RY, et al. Studies on the structure of ligustiphenol from Ligusticum sinense Oliv. Chin Chem Lett, 1996,7∶721
收稿日期：1998-06-24, 百拇医药
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